基因工程实验技术教程

内容提要 本教程的实验是以pUC118质粒为载体克隆一卡那 霉素抗性基因，转化子鉴定用快速抽提酶切法与非放射 性标记探针的菌落原位杂交法。整个实验过程包括质粒 抽提、电泳、酶切、片段回收、连接、转化、快速鉴定、探针 标记、原位吸印、杂交与检测等基因工程的最基础的实验 步骤。除上述系列实验外还有一独立的PCR实验――用 头发进行人的性别鉴定。 本书可作为基因工程实验课程的教材，也可供生物 学科有关各专业教师和科研人员参考。

目 录 绪论 本教程基因工程实验流程图 实验一 碱法抽提质粒DNA 一 实验目的 二 实验原理 （一）克隆载体pUC118质粒与宿主菌MV1184 1pUC118质粒结构 2MV1184宿主菌F＇因子基因型 3MV1184宿主菌染色体基因型 （二）质粒DNA的抽提 1裂解细胞 2分离 3纯化 （三）碱法抽提的主要试剂 （四）抽提产量与试剂用量的估算 1抽提产量估算 2试剂用量估算 三 试剂与器材 四 实验步骤 实验二 电泳法测定DNA的浓度与纯度 一 实验目的 二 实验原理 （一）琼脂糖凝胶 （二）电泳时DNA迁移的影响因素 1DNA分子质量的影响 2DNA构型的影响 3胶浓度的影响 4电场强度的影响 5溴乙锭的影响 6电泳缓冲液的影响 7碱基组成与电泳温度的影响 （三）电泳缓冲液 1TAE 2TBE 3TPE （四）上样液 （五）上样量的控制 （六）DNA电泳条带的检测 （七）电泳的分子质量梯度标志 1线状分子质量梯度标志 2超螺旋分子质量梯度标志 三 试剂与器材 四 实验步骤 实验三 载体与供体DNA的酶切 一 实验目的 二 实验原理 （一）限制性内切酶的一般性质 1一般限制酶的识别位点 2识别超长碱基序列的酶 3各类粘性末端的特点 4同识别序列的酶 5酶切反应中的位点优先现象 6DNA构型对酶切的影响 7近末端切割 8酶的星号反应 9大肠杆菌中甲基化现象对酶切的影响 10能切割单链的限制酶 （二）限制性内切酶的使用 1制作基因图谱 2克隆基因 3制备探针 （三）酶切方式 1部分酶切 2完全酶切 （四）酶的质量鉴定 （五）酶的保存 （六）酶单位的定义 （七）限制酶的作用条件 1作用温度 2缓冲体系 3反应时间 4DNA的纯度与浓度 （八）终止酶反应的方法 （九）酶切失败的原因及处理的方法 三 试剂与器材 四 实验步骤 实验四 目的基因片段的回收 一 实验目的 二 实验原理 （一）各类回收方法 1电泳回收法 2收集孔电泳回收法 3机械破碎凝胶回收法 4溶（熔）胶回收法 5琼脂糖酶降解凝胶回收法 （二）回收方法的选择与操作注意事项 三 试剂与器材 四 实验步骤 实验五 载体与供体DNA的连接 一 实验目的 二 实验原理 （一）早期的连接理论 （二）近期的计算机模拟反应进程 （三）连接酶 （四）连接反应的影响因素 1连接缓冲液的影响 2pH值的影响 3ATP浓度的影响 4连接温度与时间的影响 5酶浓度的影响 6DNA浓度的影响 7DNA序列的影响 8其他抑制因素的影响 （五）三种连接酶单位定义 1Weiss单位 2d（A―T）环化单位 3粘性末端单位 三 试剂与器材 四 实验步骤 实验六 CaCl2法转化大肠杆菌 一 实验目的 二 实验原理 （一）各种转化方法与转化率的衡量指标 （二）转化率的影响因素 1试剂（包括水）纯度与器皿清洁程度的影响 2接种前菌种保存方式的影响 3宿主菌生长时期的影响 4CaCl2法0℃放置时间的影响 5化合物与无机离子的影响 6质粒大小、构型与复制起点的影响 7竞争DNA的影响 8共转化质粒的影响 9质粒DNA与转化细胞比例的影响 10菌株基因型recA＋与recA 的影响 11连接缓冲液的影响 （三）大肠杆菌中的限制系统与限制修饰系统 1Mcr限制系统 2Mrr限制系统 3hsd限制修饰系统 （四）宿主菌的选择 三 试剂与器材 四 实验步骤 实验七 酚/氯仿法快速鉴定转化子 一 实验目的 二 实验原理 （一）DNA水平检测 1快速抽提电泳分析 2快速抽提酶切分析 3原位杂交法 4斑点杂交法 5Southern杂交法 6DNA序列分析 （二）mRNA水平检测 1R环电子显微镜法检测 2杂交抑制翻译 3杂交选择翻译 （三）蛋白质水平检测 1沉淀免疫检测法 2其他免疫检测法 （四）功能水平检测 三 试剂与器材 四 实验步骤 实验八 随机引物法标记DNA探针 一 实验目的 二 实验原理 （一）酶法标记于链上 1缺口转移法 2随机引物法 3PCR法 （二）酶法标记于末端 13′末端标记法 25＇末端标记法 （三）化学法标记于链上 1直接标记法 2介导标记法 （四）化学法标记于末端 1合成时引入氨基或巯基 2合成后引入氨基或巯基 （五）光化学法标记于链上 1芳香叠氮化合物 2呋喃香豆素衍生物 （六）人工合成于链上 1掺入碱基类似物 2掺入核糖类似物 （七）检测酶直接标记法 1检测酶直接标记于链上 2检测酶直接标记于末端 三 试剂与器材 四 实验步骤 实验九 菌落原位吸印 一 实验目的 二 实验原理 （一）各类吸印膜 1硝酸纤维素膜（NC膜） 2叠氮氧苄甲基纤维素纸（DBM纸），重氮苯硫醚 纤维素纸（DPT纸）和氨基苯硫醚纤维素纸（APT 纸） 3二乙氨基乙基纤维素纸（DEAE纸） 4ECTELA纸 5尼龙膜 6聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜） 7其他膜 （二）各种转移方法 1毛细管转移法 2真空转移法 3电转移法 三 试剂与器材 四 实验步骤 实验十 DNA分子杂交 一 实验目的 二 实验原理 （一）DNA的复性与杂交反应动力学方程式 1双链DNA的复性过程 2单链探针的杂交过程 3双链探针的杂交过程 （二）杂交速率的影响因素 1探针分子复杂性的影响 2探针分子浓度的影响 3杂交温度的影响 4杂交液pH值的影响 5杂交液中离子强度的影响 6杂交液中甲酰胺浓度的影响 7杂交促进剂的影响 （三）杂交反应的两种模式 （四）杂交分子稳定性的影响 1杂交液中Na＋离子浓度的影响 2探针分子中GC％的影响 3杂交液中甲酰胺浓度的影响 4探针分子长度的影响 5与目标DNA错配的影响 6杂交液pH值的影响 （五）杂交的步骤 三 试剂与器材 四 实验步骤 实验十一 显色法检测杂交结果 一 实验目的 二 实验原理 （一）酶法显色原理 1辣根过氧化物酶 2碱性磷酸酯酶 （二）免疫法检测原理 （三）生物素－亲和素法检测原理 （四）其他检测法 1胶体金标记――银加强检测法 2时间分辨荧光检测法 三 试剂与器材 四 实验步骤 实验十二 PCR法鉴定人的性别 一 实验目的 二 实验原理 （一）PCR的引物设计 1引物的长度 2引物的GC％含量 3引物的3′端起始碱基 4引物无回文对称结构 5引物自身不能配对 6两个引物的Tm值 7两个引物之间不能配对 （二）PCR的反应体系 1模板DNA 2引物 三 分光光度计的使用 四 电泳仪的使用 五 微量移液器的使用 六 凝胶摄影 七 酚的重蒸与饱和处理 八 RNA酶的使用与预处理 九 缓冲液作用原理与Tris・Cl的配制 十 菌种与DNA样品的保存 十一 器皿的清洗处理 十二 器皿和试剂的灭菌处理 十三 器皿的硅化处理 十四 大肠杆菌常用基因型 参考文献